Laporan Mikrobiologi - Perhitungan Jumlah Mikroba Dengan Metode TPC

BAB I

PENDAHULUAN

1.1             Latar Belakang

Kuantitasi mikroba menunjukkan jumlah koloni yang mampu di bentuk oleh mikrona tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Steril dari bakteri untuk makanan terutama minum, sangat perlu diketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempat mempunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama, untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri.

Kemurnian air minum sebenarnya sudah cukup terjamin. Akan tetapi sering kali secara sukarela masih diadakan pengujian dengan menggunakan cara “menghitung jumlah koloni pada agar-agar lempengan yang telah ditetapkan”, disingkat “penjumlahan pada lempengan” (standard plate count). Untuk ini satu atau lebih ml air contoh dicampurkan kedalam cawan agar-agar yang belum beku yang mengandung glukosa tripton. Setelah itu sebagian dari cawan-cawan disimpan dalam suhu 20°C selama 24 jam dan sebagian lainnya dalam suhu 35°C selama 24 jam. Bila jam-jam yang sudah ditentukan itu berakhir, jumlah koloni-koloni dihitung. Jika jumlah yang ditentukan masing-masing lempengan itu kurang dari pada standar yang telah ditetapkan, maka air dianggap murni.

Pada mikroorganisme, pertumbuhan individu dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan populasi. Sehingga batas antara pertumbuhan sel dan pertumbuhan populasi, serta sebagian satu kesatuan populasi yang kemudian terjadi, kadang-kadang karena terlalu cepat pertumbuhannya, sulit untuk diamati dan dibedakan.

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberi perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan.

Oleh karena itu, diadakan praktikum “Perhitungan Jumlah Mikroba Dengan Metode TPC” ini guna memberikan pemahaman tentang hal-hal yang berkaitan dengan cara-cara perhitungan jumlah mikroba dengan metode TPC serta menambah pengetahuan dann keterampilan tentang teknik atau tata cara perhitungan jumlah mikroba dengan metode TPC.

1.2             Tujuan Percobaan

a.       Mengetahui fungsi metode TPC

b.      Mengetahui jumlah koloni pada media

c.       Mengetahui teknik yang digunakan pada metode TPC

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1             Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan secara murni dapat didefinisikan sebagai pertambahan secara teratur semua komponen didalam sel hidup. Dengan demikian, pertambahan ukuran yang diakibatkan oleh bertambahnya air atau karena penumpukan lemak, bukan merupakan pertumbuhan. Pada mikroorganisme, pertumbuhan individu (sel) dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan sel dan pertumbuhan populasi, serta sebagai satu kesatuan populasi yang terjadi, kadang-kadang tertalu cepat pertumbuhannya, sulit untuk diamati dan dibedakan (Dwidjoseputro, 2005).

Umur sel jasad renik ditentukan segera setelah proses pembelahan sel selesai sedangkan umur kultur ditentukan dari waktu atau lamanya inkubasi. Ukuran sel tergantung dari kecepatan pertumbuhannya. Semakin baik zat nutrisi didalam substrat tempat tumbuhnya, mengakibatkan pertumbuhan sel semakin cepat dan ukuran sel semakin besar (Dwidjoseputro, 2005).

Akhir-akhir ini ditentukan cara pengujian yang lebih cepat dan tepat, yaitu menggunakan saringan halus yang dibuat dari semacam selulosa. Metode ini dikenal sebagai metode penyaringan (membrane filter method), cara untuk menguji pemurnian air sehingga mikroorganisme tidak terlalu banyak (Waluyo, 2004).

2.2             Cara Perhitungan Mikroba

Beberapa cara dapat dilaksanakan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan adalah cara perhitungan koloni pada lempeng biakan (plate count). Disamping itu dapat diadakan perhitungan langsung secara mikroskopis (Irianto, 2006).

1.    Cara perhitungan pada lempeng pembiakan

a.    Bahan pemeriksaan diencerkan seperlunya.

b.    Suatu volum tertentu diteteskan kedalam pinggan petrin steril, kemudian dituang dengan medium pembiakan padat yang telah dicairkan dan didinginkan sampai suhu tidak lebih dari 45°C. Setelah dicampur rata campurkan dan biarkan membeku.

c.    Metode perhitungan koloni dilakukan setelah pengeraman pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, satu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volum pengenceran yang digunakan (Irianto, 2006).

2.    Cara menghitung langsung (metode kaca objek)

Cara ini pada mulanya dilakukan dalam pemeriksaan bakteri yang terdapat dalam air susu, tetapi dapat digunakan untuk penelitian lain. Dengan cara ini yang dihitung adalah baik bakteri hidup maupun bakteri mati, sehingga dengan cara ini tidak diketahui berapa jumlah bakteri hidup, tetapi pengerjaannya lebih cepat (Irianto, 2006).

A.           Metode Bilik Hitung

Untuk keperluan ini dapat digunakan bilik hitung Helber, yaitu suatu kaca objek setelah 2 - 3 mm dengan ditengahnya terdapat suatu daerah yang disebut lantai bilik yang berada 0,02 m dibawah pernukaan kaca objek. Daerah ini dilingkari oleh parit. Permukaan kaca objek diasah sedemikian rupa, sehingga bilik kaca penutup diletakkan diatas lantai bilik terdapat ruangan antara lantai dan kaca penutup yang sama tingginya. Pada lantai bilik terdapat ruangan atau suatu daerah terdapat seluas 1mm² yang dibagi dalam 400 kotak persegi. Suspensi yang dihitung akan ditambah dengan beberapa tetes formalin. Suspensi ini diencerkan sedemikian rupa, sehingga bila dimasukkan dalam bilik hitung itu hanya terdapat lima atau sepuluh organisme dalam tiap kotak. Cara kerja adalah sebagai berikut:

a)      Satu ose suspensi diletakkan pada daerah berkotak dan diatasnya diletakkan pada kaca penutup yng bersih. Volume suspensi seharusnya hanya cukup hanya untuk mengisi ruang antara lantai bilik dengan kaca penutup, jangan sampai ada cairan yang mengalir kedalam parit.

b)      Pemeriksaan dilakukan dengan lensa 4 mm. Untuk perhitungan dipilih 50 – 100 kotak secara acak sehingga jumlah hitungan mencapai kira-kira 500. Setelah dibagi oleh jumlah kotak, diperoleh rata-rata jumlah mikroorganisme untuk setiap kotak. Kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran (Irianto, 2006).

B.            Metode Breed

Pada kaca objek dibuat petak-petak masing-masing seluas 1 cm³. Dengan suatu mikropipet diteteskan 0,01 ml cairan yang ingin dihitung kandungan bakterinya, misalnya pada air susu, kemudian dikeringkan. Selanjutnya dicat dengan melatyn blue. Pemeriksaan dilakukan dengan lensa renda minyak yang telah diketahui diameter bidang penglihatannya adalah 5,114 × 0,8² = 2 mm², maka tiap bidang penglihatannya yaitu kira-kira 0,16 mm luas bidang penglihatannya adalah 1/5000 luas petak, dengan kata lain tiap bidang penglihatan pewakili 1/5000 bagian dari volume asalnya 0,01 ml. bila ditemukan dalam tiap bidang penglihatan suatu bakteri, maka dalam 0,01 ml terdapat 5000 mikroorganisme atau 500.000 per ml. Perhitungan dilakukan pada berbagai bidang penglihatan dari petak-petak yang berbeda dan hasilnya dihitung dengan rumus (Irianto, 2006).

Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara:

1.      Jumlah bakteri secara keseluruhan (Total Plate Count)

Pada cara ini dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun mati.

2.      Jumlah bakteri yang hidup (Viable Count)

Cara ini hanya menggambarkan jumlah sel yang hidup, sehingga lebih tepat bila dibandingkan teknis diatas (Lay, 1994).

Perhitungan bakteri secara keseluruhan terbagi menjadi dua:

a.       Menghitung langsung secara nikroskopis

Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Untuk ini digunakan kaca objek khusus yang bergaris (Petroff – Hauser) berbentuk bujur sangkar. Jumlah cairan yang terdapat antara kaca objek dan kaca penutup mempunyai volume tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Pembesaran yang digunakan untuk melihat bakteri membatasi voleme cairan yang diperiksa. Hanya cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi yang dapat menggunakan cara ini.

b.      Menghitung dengan cara kekeruhan

Cara ini yang menggunakan alat spektrofometer atau nefelometer. Dasar teknik ini adalah banyaknya cahaya yang masuk atau diadsorpsi sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu. Cara ini diperlukan keterampilan teknik menghitung jumlah koloni yang hidup (Lay, 1994).

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1             Waktu dan Tempat

Pada praktikum mikrobiologi tentang analisis kualitas air dengan metode TPC dilaksanakan pada hari Jum’at tanggan 24 Mei 2013 pada pukul 15.00 – 17.30 WITA. Dilanjutkan pengamatan pada hari Senin tanggal 27 Mei 2013 pada pukul 16.00 – 17.30 WITA di Laboratorium Rekayasa Teknik Lingkungan Fakultas Teknik Universitas Mulawarman Samarinda.

3.2             Alat dan Bahan

3.2.1       Alat

1. Tabung Reaksi

2. Cawan Petri

3. Inkubator

4. Bulp

5. Neraca Analitik

6. Pipet Volume

7. Lampu Bunsen

8. Beaker Glass

9. Rak Tabung Reaksi

10. Botol Semprot

11. Hot Plate

12. Stirrer

13. Erlenmeyer

14. Alat Tulis

15. Kalkulator

16. Sprayer

17. Digital Colony Counter

3.2.2        Bahan

1. Larutan NaCL

2. Alkohol

3. Aquadest

4. Media PCA

5. Kertas Label

6. Alumunium Foil

7. Tanah Teknik

8. Tisu

3.3             Cara Kerja

3.3.1       Pengenceran

1.        Diambil larutan NaCL sebanyak 9 ml menggunakan pipet volume.

2.        Dimasukkan kedalam tabung reaksi 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, dan 10^-5.

3.        Ditimbang tanah dengan menggunakan neraca analitik sebanyak 1 gram.

4.        Dimasukkan tanah kedalam tabung 10^-1, kemudian dihomogenkan.

5.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-1 dimasukkan ke tabung 10^-2 lalu dihomogenkan.

6.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-2 dimasukkan ke tabung 10^-3 lalu dihomogenkan.

7.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-3 dimasukkan ke tabung 10^-4 lalu dihomogenkan.

8.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-4 dimasukkan ke tabung 10^-5 lalu dihomogenkan.

3.3.2        Isolasi Mikroba

1.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-3 dimasukkan ke dalam cawan petri 10^-3.

2.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-4 dimasukkan ke dalam cawan petri 10^-4.

3.        Diambil 1 ml dari tabung 10^-5 dimasukkan ke dalam cawan petri 10^-5.

4.        Dimasukkan PCA sebanyak 10 ml ke dalam masing-masing cawan petri 10^-3, 10^-4, 10^-5.

5.        Dihomogenkan dengan membentuk angka 8.

6.        Diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C.

3.3.3.     Pengamatan

1.        Diambil cawam petri 10^-5 yang telah diinkubasi.

2.        Dihidupkan digital colony counter.

3.        Diletakkan cawam petri diatas digital colony counter.

4.        Diambil dan ditandai koloni bakteri yang terdapat dalam cawan petri dengan spidol.

5.        Dihitung jumlah koloni.

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel Pengamatan

NO	Gambar	Keterangan
1.	PCA 10-3	·         Jumlah koloninya adalah ≥ 300 ·         Jumlah koloni ≥ 300 maka tidak memenuhi syarat untuk perhitungan koloni TPC.
2.	PCA 10-4	·         Jumlah koloninya adalah ≥ 300 ·         Jumlah koloni ≥ 300 maka tidak memenuhi syarat untuk perhitungan koloni TPC.
3.	PCA 10-5	·         Jumlah koloninya adalah ≥ 300 ·         Jumlah koloni ≥ 300 maka tidak memenuhi syarat untuk perhitungan koloni TPC.

4.2             Perhitungan

4.2.1       Perhitungan PCA 10^-3

Jumlah koloni = Jumlah Koloni ×

= 300 ×

= 3×10⁵ CFU/gram

4.2.2       Perhitungan PCA 10^-4

Jumlah Koloni = Jumlah Koloni ×

 = 300 ×

 = 3×10⁶ CFU/gram

4.2.3       Perhitungan PCA 10^-5

Jumlah Koloni = Jumlah Koloni ×

 = 300 ×

 = 3×10⁷ CFU/gram

4.3             Pembahasan

Metode (Total Plate Count) atau biasa disebut metode hitungan cawan merupakan metode yang paling banyak digunakan Karena mudah digunakan, akrena koloni dapat dilihat secara langsung dengan mata tanpa harus menggunakan mikroskop. Prinsip metode TPC adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka  mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk kolini yang dilihat langsung kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop.

Cara menghitung koloni dalam metode TPC yaitu pertama cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300. Kedua, beberapa koloni-koloni yang bergabung menjadi satu atau kumpulan koloni yang besar dianggap dan dihitung satu koloni. Ketiga, suatu koloni yang terlihat suatu garis tebal dihitung satu koloni. Keempat, jumlah koloni yang ada dalam setiap ml air yang diteliti diperoleh dengan pengalian jumlah koloni dengan satu per faktor pengenceran.

PCA (Plate Count Agar) merupakan sebuah media pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk menghitung jumlah mokroorganisme total yang terdapat pada setiap sampel makanan, produk susu, air limbah dan sampel-sampel lainnya yang biasa menggunakan metode TPC. Penggunaan PCA sebagai media untuk menghitung jumlah total dari mikroorganisme sudah dilakukan sejak lama. Sekarang industri-industri seperti makanan, produk susu, dan juga pengolahan limbah sudah menerapkan perhitungan jumlah total mikroorganisme pada sampel sesuai dengan standar yang ada menggunakan PCA.

Cawan tuang (pour plate), teknik ini memerlukan agar yang belum padat ( ˃ 45°C)

Untuk dituang bersama suspense bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (didalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O₂ dan ada yang tumbuh didalam agar yang tidak begitu banyak mengandung O₂. Metode cawan tuang adalah metode menumbuhkan mikroorganisme didalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stock kultur bakteri.

Pada percobaan ini. Pada media PCA 10^-3 di dapatkan jumlah koloni bakteri ≥ 300, sehingga di dapatkan jumlah koloni per gram sebanyak 3×10⁵ CFU/gram, sedangkan pada media PCA 10^-4 didapatkan jumlah koloni bakteri ≥ 300, sehingga didapatkan jumlah koloni per gram sebanyak 3×10⁶CFU/gram, dan pada media PCA 10^-5 didapatkan jumlah koloni bakteri ≥ 300, sehingga didapatkan jumlah koloni per gram sebanyak 3×10⁷ CFU/gram.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a.    Metode TPC berfungsi untuk menghitung jumlah sel mikroba yang masih hidup yang tumbuh pada media dan membentuk koloni tanpa harus menggunakan mikroskop.

b.    Jumlah koloni pada media PCA 10^-3, 10^-4, dan 10^-5 lebih dari 300 koloni, sehingga tidak dapat dihitung karena tidak memenuhi syarat untuk perhitungan koloni TPC.

c.    Pada percobaan metode TPC menggunakan teknik cawan tuang, karena teknik ini menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam (didalam agar) yang tidak begitu banyak mengandung O₂ Dan ada yang tumbuh didalam agar yang tidak begitu banyak mengandung O_2. Metode cawan tuang adalah metode menumbuhkan mikroorganisme ke dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stock kultur bakteri.

5.2 Saran

Sebaiknya pada praktikum ini dilakukan perhitungan koloni menggunakan metode yang lebih bervariasi seperti metode breed dan dengan sampel yang lebih beragam seperti air kolam renang.