Laporan Mikrobiologi - Metode MPN (Most Probable Number)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1             Latar Belakang

Air merupakan material esensial didalam kehidupan. Tidak satupun makhluk hidup didunia ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Sel hidup, baik tumbuhan, hewan, monera, protista, dan fungsi. Sebagian besar terdiri atas air. Misalnya, pada sel-sel tumbuhan terkandung lebih 75% atau didalam sel hewan terkandung lebih dari 67%. Air didalam tidak pernah dalam keadaan murni. Air murni hanya dilaboratorium dalam bentuk aquadest.

Manusia memperoleh air yang diperlukan untuk minum, masak, mandi, dan mencuci dari air hujan, dari air yang menggenang dipermukaan tanah seperti waduk, kubangan, sungai, dan sumur. Air sungai banyak mengandungan mikroganisme bai dari udara, sisa-sisa mahluk hidup, kotoran hewan maupun manusia, dan mungkin jga kotoran yang berasal dari pabrik-pabrik.

Air yang mengandung mikroganisme ini disebut  air yang terkena kontaminasi, jadi air itu tidak steril. Beberapa penyakit menular dapat sewaktu-waktu meluas menjadi wabah karena peranan air tercemar.

Kuantitas mikroba menunjukan jumlah koloni yang mampu dibentuk mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Steril dari bakteri untuk makanan terutama minuman, sangat perlu diketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempat mempunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama. Untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri.

Standar air minum, menurut standar WHO semua sample tidak boleh mengandung E.Coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform. Standar WHO dalam setiap tahun, 95% dari sample-sample tidak boleh mengandung coliform dalam 100 ml, tidak ada sample yang mengandung E.Coli dalam 100 ml, tidak ada sample yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam 100 ml, tidak ad boleh ada coliform dalam 10 ml dan dua sample yang berurutan.

Oleh karena itu, pada praktikum kali ini dilakukan percobaan dengan mengambil sample air untuk mengetahui apakah terdapat bakteri patogen pada sample tersebut, dan mengetahui jumlah bakteri yang terdapat pada sample tersebut, dengan menggunakan metode MPN (Most Probable Number).

1.2             Tujuan Percobaan

a.         Mengetahui nilai MPN dari sample

b.        Mengetahui prinsip dari MPN

c.         Mengetahui fungsi dari masing-masing media

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1             Perhitungan Mikroba

Pertumbuhan secara umum dapat didefinisikkan sebagai penambahan secara teratur semua komponen didalam sel hidup. Dengan demikian, pertambahan ukuran yang diakibatkan oleh bertambahnya air atau karena penumpukan lemak, bukan merupakan pertumbuhan. Pada organisme multiseluler (banyak sel) yang disebut pertumbuhan adalah peningkatan jumlah sel per organisme, dimana ukuran sel juga menjadi lebih besar. Pada organisme uniseluler (bersel satu) pertumbuhan adalah penambahan jumlah sel, yang juga berarti pertambahan jumlah organisme yang membentuk populasi atau suatu biakan (Dwidjoseputro, 2005).

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan lansung  maupun tidak lansung. Perhitungan secara lansung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak lansung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secar lansung, dapat dilakukan dngn beberapa cara antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai). Seangkan perhitungan dengan cara tidak lansung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (Dwidjoseputro, 2005).

Umur sel jasad renik segera setelah proses pembelahan sel selesai sedangkan umum kultur ditentukan dari waktu atau lamanya inkubasi. Ukuran sel tergantung dari kecepatan pertumbuhannya. Semakin baik zat nutrisi didalam substrat tempat tumbuhnya, mengakibatkan pertumbuhan selsemakin cepat dan ukuran sel semakin besar (Dwijoseputro, 2005).

Pengukuran pertumbuhan, ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk mengukur atau menghitung jumlah jasad renik, yaitu:

a.         Perhitungan jumlah sel

-        Hitungan mikroskopik

-        Hitungan cawan

-        MPN (Most Probable Number )

b.        Perhitungan massa sel secera lansung

-        Cara volumetrik

-        Cara gravimetrik

-        Turbidimetri (kekeruhan)

c.         Perhitungan massa sel secara tidak langsung

-            Analisis komponen sel secara protein, AND, ATP, dan sebagainya

-            Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit skunder, panas)

-            Analisis komsumsi nutrient (karbon, nitrogen, oksigen, asam aminum meniral, dan sebagainya)

(Dwidjoseputro, 2005).

Perhitungan massa sel secara langsung maupun perhitungan massa sel secara tidak langsung jarang digunakan dalam menguji jumlah mikroba pada bahan, teteapi juga sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung,  jumlah mikroorganisme dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak menggangu pengukiran (Dwidjoseputro, 2005).

Metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan  berat sel dilakukan terlebih dahulu dengan menyaring mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, bila substrat tempah tumbuhya banyak mengandung padatan, misalnya bahan pangan, sel mikroorganisme tidak dapat diukur dengan menggunakan metode volumetrik maupun dengan turbudimetri. Perhitungan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel-sel selama proses fermentasi dimana komponen substrat atau bahan yang difermentasikan dapat diamati dan diukur (Dwidjosaputro, 2005).

2.2             Metode MPN (Most Probable Number)

Metode MPN (Most Probable Number) terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumptive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji pelengkap (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan kloriform masih dalam tingkat probabilitas rendah, masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif cloriform dalam sample. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat didalam tanah seperti Nitrosomohas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksitanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro, 2005).

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukan bahwa air  atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator  sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri tersebut dalam air atau makan dapat menunjukan bahwa dalam satu atau lebih terhadap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri  patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menujukan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichiacoli, kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfrigens (Hastowo, 1992).

2.3             Escherichiacoli

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.Coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai caliform fekal. Pengujian caliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.Coli karena hanya memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 2005).

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1             Waktu dan Tempat

Prktikum uji penduga dilaksanakan pada hari Rabu, 22 Mei 2013 pukul 15.00 – 17.30 WITA, dilakukan dengan pengamatan hasil percobaan uji penduga dan praktikum uji penegas pada hari kamis, 23 Mei 2013  pukul 15.00 – 17.30 WITA, dan dilanjutkan lagi dengan pengamatan hasil percobaan uji penegas  dan praktikum uji pelengkap pada hari jum’at pukul 15.00 – 17.30 WITA, kemudian dilanjutkan lagi pengamatan hasil percobaan uji pelengkap pada hari senin, 27 Mei 2013 pukul 16.00 – 17.30 WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkungan Fakultas Teknik Universitas Mulawarman, Samarinda.

3.2             Alat dan Bahan

3.2.1       Alat

1.        Tabung reaksi

2.        Rak tabung reaksi

3.        Tabung durham

4.        Neraca analitik

5.        Botol sample

6.        Cawan petri

7.        Spatula

8.        Labu erlenmeyers

9.        Beaker glass

10.    Bulp

11.    Pipet ukur

12.    Jarum ose

13.    Inkubator

14.    Pinset

15.    Botol semprot

16.    Hot plate

17.    Batang pengaduk

18.    Alat tulis

19.    Kalkulator

20.    Spidol

21.    Stirrer magnetic

22.    Lampu bunsen

23.    Sikat pencuci tabung

24.    Colory counter

25.    Sprayer

3.2.2       Bahan

1.        Media LB (Lactose Broth)

2.        Media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth)

3.        Media EMBA (Eosin Methylere Bblue Agar)

4.        Aquadest

5.        Alkohol

6.        Air sungai karang mumus

7.        Kertas label

8.        Alumunium Foil

9.        Larutan NaCl 0.9%

10.    Sabun

11.    Korek api

3.3             Cara Kerja

3.3.1       Uji Penduga

1.        Dibuat media LB (Lactose Broth).

2.        Disiapkan 3 tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml NaCl.

3.        Dimasukkan 1 ml air sample ke dalam tabung reaksi 1 yang berisi NaCl (pengenceran ), dihomogenkan.

4.        Dipipet 1 ml larutan dari tabung reaksi pengenceran  dan dimasukkan kedalam tabung reaksi 2 (pengeceran ), di homogenkan.

5.    Dipipet 1 ml larutan dari tabung reaksi  pengeceran dan dimasukkan kedalam tabung reaksi 3 (pengenceran ), dihomogenkan.

6.        Disiapkan 9 tabung reaksi berisi tabung durham, kemudian diisi dengan 9 ml media LB kedalam masing-masing tabung reaksi.

7.        Dipipet 1 ml larutan dari engenceran , dimasukkan kedalam tabung reaksi seri pertama (sebanyak 3 tabung reaksi), ditutup dengan aluunium foil dan dihomogenkan  dan dieluarkan gelembung udara didalam tabung durham lalu diberi kertas label.

8.        Dipipet 1 ml larutan dari pengenceran , dimasukkkan kedalam tabung reaksi seri kedua (sebanyak 3 tabung reaksi), ditutup dengan alumunium foil, dihomogenkan dan dikeluarkan gelmbung udara didalam tabung durham dan diberi kertas label.

9.        Dipipet 1 ml  larutan dari pengenceran ,dimasukkan kedalam tabung reaksi seri ke tiga (sebanyak 3 tabung reaksi), ditutup dengan alumunium foil, dihomogenkan dan dikeluarkan gelembung udara didalam tabung durham kemudian diberi kertas label.

10.  Diinkubasi 9 tabung reaksi tersebut selama 24 jam pada suhu 37C.

3.3.2       Uji Penegas

1.        Dibuat Media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth).

2.        Disiapkan 9 tabung reaksi yang berisi larutan dari hasil uji penduga.

3.        Disiapkan 9 tabung reaksi yang berisi tabung durham.

4.        Dipipet media BGLBB sebanyak 9 ml lalu dimasukan kedalam masing-masing tabung reaksi yang berisi tabung durham.

5.        Difiksasi jarum ose kemudian diambil satu ose larutan dari seri pertama (pengenceran )  kedalamtabung reaksi seri pertama yang berisi media BGLBB (sebanyak 3 tabung),ditutup alumunium foil, dihomogenkan dan dikelurkan gelembung udara yang didalam tabung durham.

6.        Difiksasi jarum ose kemudian diambil satu ose larutan dari seri kedua (pengenceran  kedalam tabung reaksi seri kedua yang berisi media BGlBB (sebanyak 3 tabung), ditutup alumunium foil, dihomogenkan dan dikeluarkan gelembung udara yang ada didalam tabung durham.

7.        Difiksasi jarum ose kemudian dimbil satu ose larutan dari seri ketiga ( Pengenceran ) kedalam tabung reaksi seri ketiga yang berisi media BGLBB (sebanyak 3 tabung), ditutup alumunium foil, dihomogenkan dan dikeluarkan gelembung udara yang didalam tabung durham.

8.    Diberi kertas label lalu diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37C

3.3.3       Uji pelengkap

1.        Dibuat Media EMBA (Eosin Methylere Blue Agar).

2.        Diambil tabung reaksi dari uji penegas yang telah diinkubasi.

3.        Diambil media EMBA padat, dibagi menjadi 3 bagian.

4.        Diambil satu ose pada setiap tabung pengenceran .

5.    Disteakkan pada media EMBA

6.    Diambil satu ose pada setiap tabung pengenceran

7.    Distreakkan Pada media EMBA

8.    Diambil satu ose pada setiap tabung pengenceran

9.    Disteakkan Pada media EMBA

10.  Diberi kertas label dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1             Tabel pengamatan

No.	Media	Seri Pengenceran			Tabel MPN	Bakteri
1	LB	3	3	3	≥ 24,00	2400
2	BGLBB	3	3	3	≥ 24,00	2400
3	EMBA	0	0	0	< 0,03	3

4.2             Perhitungan

4.2.1        Uji Penduga

 Bakeri = Nilai tabel MPN ×

= 24 ×

= 2400 MPN/100 ml

4.2.2       Uji Penegas

∑ Bakteri = Nilai tabel MPN ×

= 24 ×

= 2400 MPN/100 ml

4.2.3      Uji Pelengkap

∑ Bakteri = Nilai tabel MPN ×

= 0,03 ×

= 3 MPN/100 ml

4.3             Pembahasan

Metote MPN (Most probale Number) adalah metode yang digunakan untuk menghitung coliform didalam air denagan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Tiga pengujian itu diantaranya adalah uji penduga, uji penegas, dan uji pelengkap. Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung bakteri pada  air, khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri coliform yang merupakan kontaminan utma sumber air minum.

Prinsipdari metode MPN adalah mengencerkan sampel sampai tingkaat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas atau sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif. Semakin besar jumlah sample yang dimasukkan maka semakin sering tabung positif yang mncul. Begitu pula sebaliknya.

Uji penduga adalah satu seri yang berisi 9 atau 12 tabung yang berisi LB dan tabung durham diinokulasikan dengan sampel air untuk menguji apakah air tersebut mengandung bakteri yang bisa memfermentasikan laktosa yang memproduksi gas. Jika setelah diinkubasi gas timbul pada LB diduga ada bakteri coliform disampel air tersebut. Ujipenduga merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri caliform berdasarkan terbentuknya asam gas yang disebabkan karena fermentsai laktosa oleh bakteri golongan E.Coli. terbentuknya asam dilihat dari keseluruhan pada meia laktosa,dan gas yang dihasilkan dapat diliahat dalam tabung durham yang berupa gelembung udara. Banyaknya kandungan bakteri E.Coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukan reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN dan jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung dari masing-masing seri, MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN.

Uji pelengkap merupakan uji dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inokulasi 1 × 24 jam, suspensi diinokulasikan pada media EMBA secara aseptik dengan menggunakan jarum ose. Koloni bakteri E.Coli tumbuh berwarna kehijauan dengan kilap metalik.

Uji penegas untuk menentukan bakteri E.Coli. Dan koloni yang berwarna pada uji pelngkap. Uji penegas merupakn suatu uji yang dilakukan sebelum uji pelngkap. Pada uji penegas media yang digunakan adalah BGLBB. Dimana pada media ini diliahat permentasi laktosa pad bakteri e-coli dengan terbentuknya assam dan gelembung. Pada uji penegas banyaknya bakteri dilihat dengan menghitung gelembung didalam tabung darham dan  dihitung jumlah bakteri dengan melihat hasil dari MPN tabel dikali sepuluh per pengenceran tengah dan dari hasil uji penegas akan disimpulkan dengan uji pelengkap.

Media LB (Lactose Broth) adalah media yang berfungsi untuk melihat ada tidaknya mikroba yang tumbuh pada tabung yangsudah diberi air sampel yang telah dikubasi pad suhu dan waktu tertentu. Untuk mengetahui ada tidaknya mikroba pada sample air adalah dengan melihat timbulnya kekeruhan dan adanya gelembung udara pad tabung durham.

Media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) merupakan medium selektif yang mengandung garam bile sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif. Dengan demikian, hanya bakteri gram negatif yang memfermentasikan  laktosa dan pembentuk gas yang dapat tumbuh termasuk caliform yang dapat hidup. BGLBB juga berfungsi sebagai penghambat flora mikroba yang tidak diharapkan.

Media EMBA (Eosin Mathylen Blue Agar) adalah media yang berfungsi untuk melihat ada atau tidak adanya kooni yang tumbuh setelah jarum ose dinokulasikan dengan cara digoreskan pada medium EMBA diketahui ada atau tidaknya koloni. Dapat dilihat dari adanya koloni berwarna kunung seperty mata ikan atau berwarna keperakkan. Medium EMBA yang menggunakan eosin dan methylen sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang merugikan laktosa dan yang tidak.

Bakteri E.Coli memiliki manfaat dan bahaya bagi manusia. Bakteri E.Coli yang berada  didalam usus besar manusia berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri jaahat, dia juga membantu dalam roses pencernaan  termasuk pembusukan sisa-sisa makanan makannan dalam usus besar. Fungsi  utama yang lain dari E.Coli adalah membantu memproduksi vitamin K melalui proses pembusukan sisa makanan. Vitamin K berfungsi untuk pembekuan darah. Namun, dalam jumlah yang berlebihan bakteri E.Coli dapat mengakibatkan diare,  dan bila bakteri ini menjalar kesistem atau organ tubuh yang lain dapat menginfeksi. Seperti pada saluran kencing, jika bakteri E.coli sampai masuk kesaluran kencing dapat mengakibatkabn infeksi saluran kencing. Menurut baku mutu jumlah maksimum bakteri E.Coli yang memperbolehkan per 100 ml air dalam perairan adalah 1000 CFU untuk lokasi rekreasi.

Adapun alat yang digunakan salah satunya adalah tabung durham .tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil. Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam semua dalam media jangan sampai ada sisa udara. Fungsi tabung ini adalah sebagai indikator terjadinya fermentasi. Fermentasi menjadi gelembung-gelembung utara muncul pada bagian tabung kecil didalam tabung durham.

Adapun faktor kesalahan yang terjadi, yaitu pada saat pengambilan larutan, volumenya tidak tepat seperti yang diinginkan, lalu pada saat menginokulasi larutan, jarum ose masih terlalu panas.

Adapun hasil dari percobaan ini ialah pada uji penduga media yang digunakan adalah media LB. Pada media LB, untuk pengeceran  ketiga tabung bersifat fositip, begitu juga pengeceran dan , ketiga tabung dari masing-masing pengenceran bersifat fositif.sehinggga didapat nilai tabel MPN ≥ 24.00 dan jumlah bakteri sebanyak 2.400. pada uji penegas media yang digunakan adalah media BGLBB, dari pengenceran dan , didapat dari masing-masing pengencer 3 tabung bersifat positif. Sehingga didapat nilai tabel  MPN ≥ 24,00 dan jumlah bakteri sebanyak 2.400. dan pada uji pelengkap, ketiga pengenceran bersifat negatif sehingga didapat angka 0 untuk masing-masing pengenceran dan didapat nilai tabel MPN  0.03 dan jumlah bakteri sebanyak 3.

BAB V

PENUTUP

5.1             Kesimpulan

a.     Adapun nilai tabel MPN dari masing-masing media yaitu , pada media LB didapat nilai tabel MPN  24,00, pada media BGLBB didapat nilai tabel MPN  24,00, dan pada media EMBA didapat nilai tabel MPN  0,03.

b.        Prinsip dasar dari MPN adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai jika ditanam dalam tabung menghsilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif.

c.         Adapun fungsi dari media LB yaitu untuk mendeteksi kehadiran bakteri caliform, sedangkan fungsi dari media BGLBB sebagai pengkonfirmasi hasil tes positif uji penduga,dan fungsi media EMBA adalah untuk memilih mikroba yang memfermentasikan laktosa.

5.2             Saran

Sebaiknya digunakan juga air sampel yang lain, yang bisa langsung diminum misal air kelapa atau air minum kemasan.