Laporan Mikrobiologi - Cara-cara Pewarnaan

BAB I

PENDAHULUAN

1.1             Latar Belakang

Di dalam dunia kimia bakteri memegang peranan sangat penting dalam proses yang berlangsung di dalam kimia, hampir semua aspek kehidupan kita pun tak pernah lepas dari hubungannya terhadap bakteri dan mikroba. Beratus spesies bakteri menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif dan pewarnaan gram.  Pewarnaan basa adalah pewarnaan yang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yangtidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparat bakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna yang bersifat asam seperti tinta cina. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Hasil akhir dari pewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu atau biru, sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Oleh karena itu dilakukan percobaan untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

1.2             Tujuan Percobaan

a.       Mengetahui macam-macam pewarnaan bakteri.

b.      Mengetahui zat-zat yang digunakan dalam pewarnaan bakteri.

c.       Mengetahui fungsi dari pewarnaan bakteri.

d.      Mengetahui perbedaan gram positif dan gram negative.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1            Sejarah Pewarnaan

Di alam ini mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Trie, 2012).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif.

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya.

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk:

1.      Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai

2.      Melekatkan bakteri pada glass objek

3.      Mematikan bakteri

2.2             Jenis-jenis Pewarnaan

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1.      Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen atau air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen dan ungu kristal.

2.      Pewarnaan differensial

a.       Pewarnaan gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat berlemak didalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.

b.      Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis .

3.      Pewarnaan khusus

a.       Pewarnaan Spora

Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.Spora bakteri sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  karbol-fukhsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam Mycolic dari Mycobacterium.

b.      Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

c.       Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

4.      Pewarnaan negatif

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti tinta cina. Pewarna asam memiliki negativecharge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1             Waktu dan Tempat

Praktikum cara-cara pewarnaan ini dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 2 Mei 2013 pukul 15.30 – 18.30  WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkunganbertempat di Fakultas Teknik Universitas Mulawarman Samarinda.

3.2             Alat dan Bahan

3.2.1        Alat-alat

1.      Pipet tetes

2.      Kawat ose

3.      Lampu bunsen

4.      Cawan petri

5.      Kaca preparat

6.      Mikroskop

7.      Tabung reaksi

8.      Gelas kimia

9.      Botol semprot

10. Cover Glass

11. Korek gas

12. Beaker Glass

13. Object Glass

14. Alat tulis

15. Incubator

3.2.2        Bahan-bahan

1.      Air bersih

2.      Kertas label

3.      Sabun pencuci

4.      Larutan zat warna crystal violet

5.      Larutan zat warna tinta cina

6.      Alkohol

7.      Larutan lugol

8.      Larutan zat warna safranin

9.      Larutan malachite green

10.  Aquades

11.  Bakteri E. Coli

12. Bakteri Staphylococcus

13. Tisu

14. Kertas saring

3.3             Cara Kerja

3.3.1        Pewarnaan sederhana

1.      Dibersihkan kaca preparat dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu.

2.      Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3.      Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas kaca preparat.

4.      Dikeringkan kaca preparat dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5.      Difiksasi dengan dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

6.      Didinginkan lalu diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes, dan dibiarkan selama 1 atau 2 menit.

7.      Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

8.      Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

9.      Diamati dengan menggunakan mikroskop.

10.  Digambar bentuk bakteri.

3.3.2        Pewarnaan negatif

1.        Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak.

2.   Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3.   Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4.   Difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

5.   Diteteskan larutan zat warna tinta cina diatas object glasshingga merata.

6.      Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

7.      Diamati dengan menggunakan mikroskop.

8.      Digambar bentuk bakteri.

3.3.3        Pewarnaan gram

1.      Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu.

2.      Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3.      Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4.      Dikeringkan object glassdengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5.      Difiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen.

6.      Didinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit.

7.      Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

8.      Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

9.      Diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit.

10.  Dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan diangin-anginkan.

11.  Dicuci dengan alkohol selama 30 detik.

12.  Diteteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes.

13.  Dicuci dengan aquades.

14.  Diamati dengan menggunakan mikroskop.

15.  Digambar bentuk bakteri.

3.3.4        Perwarnaan spora

1.      Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu.

2.      Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

3.      Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4.      Dikeringkan object glassdengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

5.      Ditutup object glassdengan kertas saring.

6.      Diteteskan malachite green sebanyak 2 atau 3 tetes.

7.      Dilewatkan diatas api lampu bunsen hingga terlihat uap, jangan sampai zat warna mendidih dan mengering.

8.      Didiamkan 1 menit lalu dibuang kertas saring.

9.      Dicuci dengan aquades dan dibiarkan selam 30 detik.

10.  Diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik.

11.  Diangin-anginkan hingga zat warna kering.

12.  Diamati dengan menggunakan mikroskop.

13.  Digambar bentuk bakteri.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1             Hasil Pengamatan

4.1.1 Tabel Hasil Pengamatan Bakteri Yang Terbentuk

No	Gambar	Keterangan
1.	Pewarnaan Sederhana	1.      Bakteri Bentuk: basil (tongkat) Warna: ungu Perbesaran: 10 x 10
2.	Pewarnaan Negatif	1.      Bakteri Bentuk: coccus (bulat) Warna: kuning Perbesaran: 10 x 10
3.	Pewarnaan Gram	1.      Bakteri Bentuk: filamentous Warna: merah Jenis: Gram negatif Perbesaran: 10 x 10
4.	Pewarnaan Spora	1.      Spora bakteri Bentuk: filamentous Warna: hijau Perbesaran: 10 x 10

4.2             Pembahasan

Praktikum yang telah dilakukan menggunakan 4 metode pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram dan pewarnaan spora. sebelum diberi larutan, terlebih dahulu dibersihkan dengan akuades, alkohol dan tisu. Setelah dibersihkan, difiksasi di atas nyala lampu bunsen. Diberikan larutan zat warna pada masing-masing metode pewarnaan. Setiap metode pewarnaan membutuhkan larutan zat warna yang berbeda beda. Setelah diberi, didiamkan dan dicuci dengan akuades dengan alkohol. Setelah itu diamati bakteri tersebut di bawah mikroskop.

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet, metylen blue, karbol, fuchsin, dan safranin. Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna (negatif). Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteri melainkan ke dalam latar belakangnya.

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fukhsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri, sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci.

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis. Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya.

Crystal violet adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat-sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing. Crystal violetdipakai sebagai zat warna primer dikarenakan mampu melekatkan bakteri pada kaca dan mencegah autolisis pada sel,  membuat sel-sel lebih kuat atau keras,  mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel,  mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat.

Nigrosin (tinta cina) adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran nitrobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif  bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan  metode biasa.

Lugol’s iodide, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis. Fungsi larutan lugol, yaitu meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri, untuk memperjelas zat warna, dan mempersulit kelarutan zat warna.

Safranin adalah pewarna biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh inti sel darah merah. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan. Safranin biasanya memilki struktur kimia, juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam kimia analitik. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme non target.

Alkohol yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu, mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, bakteri menjadi tidak berwarna.

Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan untuk melihat bakteri batang pembentuk spora. Untuk membuat larutan malachite green dapat digunakan bahan kimia dari malachite green oxalate.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25–50 nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogannya tipis (1-3 nm).

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10–15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2.      Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalamlapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

3.      Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

4.      Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

6.      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2.      Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3.      Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4.      Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6.      Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

Mikroskop adalah alat yang di gunakan untuk melihat, atau mengenali benda-benda renik yang terlihat kecil menjadi lebih besar dari aslinya.

Gambar 4.1.1 Mikroskop

Berikut adalah bagian-bagian mikroskop beserta fungsinya:

1.      Lensa okuler, yaitu lensa yang dekat dengan mata pengamat lensa ini berfungsi untuk membentuk bayangan maya, tegak, dan diperbesar dari lensa objektif.

2.      Lensa objektif, lensa ini berada dekat pada objek yang diamati, lensa ini  membentuk bayangan nyata, terbalik, dan diperbesar. Dimana lensa ini diatur oleh revolver untuk menentukan perbesaran lensa objektif.

3.      Tabung mikroskop, tabung ini berfungsi untuk mengatur fokus dan menghubungan lensa objektif dengan lensa okuler.

4.      Pemutar kasar (Makrometer), makrometer berfungsi untuk menaik turunkan tabung mikroskop secara cepat.

5.      Pemutar halus (Mikrometer), pengatur ini berfungsi untuk menaikkan dan menurunkan mikroskop secara lambat, dan bentuknya lebih kecil daripada makrometer.

6.      Revolver, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara memutarnya.

7.      Reflektor, terdiri dari dua jenis cermin yaitu cermin datar dan cermin cekung. Reflektor ini berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin kemeja objek melalui lubang yang terdapat dimeja objek dan menuju mata pengamat. Cermin datar digunakan ketika cahaya yang dibutuhkan terpenuhi, sedangkan jika kurang cahaya maka menggunakan cermin cekung karena berfungsi untuk mengumpulkan cahaya.

8.      Diafragma, berfungsi untuk mengatur banyak sedikitnya cahaya yang masuk.

9.      Kondesor, kondensor berfungsi untuk mengumpulkan cahaya yang masuk, alat ini dapat putar dan di naik turunkan.

10.  Meja mikroskop, berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati.

11.  Penjepit kaca, penjepit ini berfungsi untuk menjepit kaca yang melapisi objek agar tidak mudah bergeser.

12.  Lengan mikroskop, berfungsi sebagai pegangang pada mikroskop.

13.  Kaki mikroskop, berfungsi untuk menyangga atau menopang mikroskop.

14.  Pengatur sudut, untuk mengatur sudut atau tegaknya mikroskop.

Pada percobaan kali ini dilakukan beberapa jenis pewarnaan yaitu, pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram, dan pewarnaan spora.Langkah pertama adalah membersihkan object glass dengan alkohol agar bebas dari mikroba pengganggu, lalu dibersihkan dengan aquades agar alkohol tidak menggangu proses pewarnaan nantinya. Selanjutnya difiksasi, fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

Pada pewarnaan sederhana digunakan zat warna crystal violet. Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan sederhana didapatkan bakteri dengan bentuk basil dengan menggunakan perbesaran 400.Pada pewarnaan negatif digunakan zat warna tinta cina. Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan negatif didapatkan bakteri dengan bentuk coccus yang tampak transparan dengan menggunakan perbesaran 400. Pada pewarnaan gram digunakan dua zat warna yaitu crystal violet dan safranin. Crystal violet ini merupakan zat warna utama dalam pewarnaan gram, dan safranin merupakan zat warna kedua karena safranin digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Sedangkan lugol digunakan untuk mengintensifkan warna utama atau warna dari crystal violet. Dan alkohol yang merupakan larutan pencuci digunakan untuk melunturkan zat warna utama.

Pada perwarnaan spora digunakan zat warna malachite green karena spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa. Untuk pewarnaan endospora, perlu dilakukan pemanasan supaya zat warna malachite green  bisa masuk ke dalam spora. Untuk itulah dilakukan pemanasan diatas api bunsen dengan ditutup dengan kertas saring hingga terlihat uap. Pemanasan ini agar pori-pori bakteri membesar sehingga zat warna malachite greendapat masuk dan dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna malachite greentidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan alkohol, sedangkan pada badan bakteri zat warna dilepaskan dan mengambil warna merah dari safranin. Pada percobaan ini didapatkan spora yang seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air. Juga pada saat proses fiksasi saat bakteri berada di atas object glass, jika terlalu panas maka bakteri tersebut akan mati, Dan dalam melakukan langkah-langkah pewarnaan, jangan sampai tertukar, karena jika tertukar maka hasilnya akan berbeda.

BAB V

PENUTUP

5.1             Kesimpulan

a.       Jenis-jenis pewarnaan bakteri antara lain, pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial seperti pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, dan lain-lain,  pewarnaan khusus seperti pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, dan lain-lain, dan pewarnaan negatif.

b.      Zat-zat yang sering digunakan untuk pewarnaan bakteri antara lain, crystal violet, safranin, tinta cina, dan malachite green.

c.       Manfaat dari pewarnaan bakteri adalah untuk mengetahui bakteri tersebut memiliki warna yang beragam tergantung dari jenis pewarnaan dan dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dalam pewarnaan gram.

d.      Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet ketika dilakukan pewarnaaan gram, begitupun sebaliknya. serta perbadaan terjadi pada dinding selnya

5.2             Saran

Sebaiknya untuk percobaan yang akan datang, larutan zat warna yang digunakan dalam percobaan lebih banyak dan bervariasi dan bakteri yang digunakan lebih dari satu jenis agar praktikan lebih mengetahui macam-macam warna, bentuk dari masing-masing bakteri. Serta dilakukan jenis-jenis pewarnaan yang lebih beragam, misalnya pewarnaan tahan asam dan pewarnaan flagel.

DAFTAR PUSTAKA

1.                  Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.

2.                  Pelczar, Michael. 1986. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakata: U dan D.

3.                  Trie, Ita. 2012. Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri. http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html. Diakses tanggal 24 April 2013 pukul 16.53 WITA.